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万历二十六年,秦良玉作为女将军,第一次参与了实战。这一年,播州宣抚使杨应龙勾结当地九个生苗部落举旗反叛,播州在现在贵州省遵义一带,地势险峻,山高水险,叛军依仗着天然屏障,猖獗一时。朝廷派遣李化龙总督四川、贵州、湖广各路官军,合力进剿。马千乘与秦良玉率领三千白杆兵也在其中。几经交战,叛军无力招架,退守播州,城外设下五道关卡,分别是邓坎、桑木、乌江、河渡和娄山关。
攻打邓坎,秦良玉带领五百白杆兵为主力,此战中,秦良玉在战阵中生擒敌将杨朝栋,攻克邓坎。接着又顺利地拿下了桑木、乌江、河渡三关,直达播州外的娄山关。为攻克娄山关,马千乘、秦良玉并骑奔敌,在正面吸引敌军注意,而命其他白杆兵将士从关卡两侧的悬崖处,凭着白杆长矛首尾相接,攀越上关,对敌军形成合围。叛军大败,娄山关也被攻克。娄山既失,播州无险可守,被官军收复,杨应龙全家自焚而死,叛乱平息。明廷朝议,白杆兵“为南川路战功第一”。